western blot

 

A técnica western blot, também conhecida como ensaio imunoenzimático, refere-se a imunodetecção de proteínas em filtro de nitrocelulose ou de PVDA, é rotineiramente utilizado para a detecção de proteínas e em extratos protéico cru, varredura e caracterização de polipeptídeos recombinantes, detecção de produtos de degradação protéica, caracterização de soros e anticorpos monoclonais, caracterização de epitopos, determinação de massa molecular entre outros.

A técnica consiste na detecção de pequenas quantidades de proteínas adsorvidas na membrana pela reação com anticorpos específicos desenvolvidos para reconhecer o polipeptídeo em exame. O anticorpo específico é adicionado à membrana e deixado reagir por certo período de tempo, após o qual uma fração do anticorpo fica retida na região da membrana que contém o polipeptídeo específico.

Em um segundo estágio, esse anticorpo adsorvido especificamente sobre o polipeptídeo é detectado com um anti-soro, ou seja, um anticorpo anti-anticorpo específico (ou segundo anticorpo/ conjugado) que foi quimicamente modificado pelo acoplamento covalente de uma ou mais moléculas de uma enzima. Esse reagente tem como função detectar o anticorpo específico e permitir a sua visualização em razão da atividade enzimática associada.

Com o auxílio de substratos sintéticos para a enzima conjugada, é possível visualizar a região do filtro onde está localizado o polipeptídeo ensaiado. O substrato utilizado é capaz de precipitar e formar uma camada colorida exatamente onde está localizado o segundo anticorpo e, portanto, o anticorpo específico, e, em última instância, o polipeptídeo ao qual se quer detectar.

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